口腔颌面部组织再生专栏冻干牙的制备及其生
作者姓名：伍美玲1，2，刘安琪1，2，郭晓贺1，2，李蓓2，金岩2，轩昆1
基金项目：国家自然科学基金面上项目（），陕西省青年人才项目（JQ）
作者单位：1.军事口腔医学国家重点实验室，第四军医大学口腔医学院儿童口腔科，陕西西安；2.医院组织工程研发中心，陕西西安
通信作者：轩昆，电子信箱：xuankun
fmmu.edu.cn摘要目的检测和分析冻干牙的机械性能以及生物相容性，探讨其作为牙再生支架材料的可行性。方法临床收集单根的多生牙及正畸拔除牙，通过牙体预备、脱脂、去蛋白、深冷冻、冷冻干燥、消毒灭菌等过程制备冻干牙；首先利用扫描电镜观察其表面形态和微观结构，显微硬度测试其机械性能；进而将人乳牙牙髓干细胞（SHED）和冻干牙片进行复合培养，电镜观察细胞形态变化，Hoechst染色后观察SHED细胞数目的变化，四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测冻干牙对SHED增殖活性的影响。结果经过冻干处理的牙根表面及髓腔清洁，并保持完整的牙齿微观结构；冻干牙的显微硬度和正常对照牙无显著差别；冻干牙片表面SHED黏附生长情况要优于正常牙片，此外活细胞数量与正常对照在培养18h时差异有统计学意义（P0.05）；而冻干牙对SHED增殖活性的影响低于与正常对照。结论制备的冻干牙不仅保持原有的形态结构和机械性能，并且与具有良好的生物相容性，是一种理想的牙再生支架材料。
关键词冻干牙；乳牙牙髓干细胞；生物学性能
牙再生是组织工程与再生医学在口腔医学研究领域应用的热点，具有十分重要的临床研究价值和科学研究意义［1］。近年来，多种牙源性间充质干细胞已被分离培养作为种子细胞用于牙体牙髓牙周乃至全牙再生的实验研究［2］。人脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）因其较强的增殖能力、多向分化潜能及较易的获取途径成为组织工程与再生医学理想的种子细胞［3］。同时，寻找生物相容性好、无毒且能促进单种或多种牙体组织再生的生物支架材料在牙再生中也起着关键作用［4］。牙本质基质作为天然的细胞外支架材料，不仅具有极好的生物相容性、低毒性和低免疫原性，其牙本质小管所包含的细胞生长因子和蛋白因子等成分还能为细胞提供一个与天然牙齿发育相似的微环境［5］。冷冻干燥法是制备组织工程支架材料常用的一种方法，它能保持材料原有的结构形态，从而利于长期保存，并且能在降低免疫原性的同时保留有利于组织再生的诱导因子［6］。本实验通过制备人冻干牙，观察其显微结构及进行机械性能检测，探讨冻干牙作为牙体再生组织工程支架材料的可行性。并将SHEDs接种于其上，通过观察对SHEDs生长情况的影响来判断冻干牙的生物相容性，以期能为后续利用冻干牙复合SHEDs进行牙体组织再生实验研究提供理论及实践基础。
1材料和方法
1.1主要材料和仪器多生牙及正畸拔除牙（医院提供）；氯仿、PBS、无水乙醇、ɑ-MEM培养基、四甲基偶氮唑盐（MTT）（Sigma公司，美国）；二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司）；金刚砂车针（马尼，日本）；超低温冰箱（海尔集团）；真空冷冻干燥机（Osterode/Harz，德国），扫描电镜（VEGA3，捷克）；自动酶标检测仪（BioTek，美国）；Matlab软件（MathWorks，美国）；SYJ-低速金刚石切割机（沈阳科晶设备制造有限公司）；15JE维氏显微硬度仪（上海光学仪器厂）；HitachiS-场发射扫描电镜（Hitachi，日本）；LeicaDMB正置显微镜照相系统（Leica，德国）。
1.2方法
1.2.1人冻干牙制备取单根的多生牙及正畸拔除牙，刮除牙周膜，拔除牙髓，行牙体预备，次氯酸钠超生震荡清洗后，经甲醛、氯仿（1∶1）室温下脱脂4h，15%过氧化氢脱蛋白12h，去离子水超声清洗1h，置于-80℃冰箱预冻3d，冷冻干燥机中冻干24h，真空包装消毒灭菌备用。
1.2.2冻干牙结构观察采用直接劈开法，分别暴露冻干牙及正常未处理牙本质小管横断面进行扫描电镜检测，观察冻干牙内部结构的变化。
1.2.3冻干牙显微硬度测试取临床拔除的前磨牙20颗，每颗牙齿制作一个待检样本，方法如下：硬组织切片机流水冷却下垂直于牙长轴将牙冠切成2mm厚的圆柱形片状，用抛光膏及抛光磨头打磨牙片表面直至镜面。样本超声清洗后，使用维氏显微硬度仪以0.49N的载荷压入其表面，每个样本选取3个不同位点进行维氏显微硬度（HV）测量，求三者平均值作为该样本（正常对照牙）的显微硬度值结果。将试样进行冻干处理后，重复上述方法重新测量作为冻干牙显微硬度值结果。
1.2.4SHEDs的分离培养及干细胞鉴定（1）脱落SHEDs的分离培养：取出临床患者脱落乳牙的牙髓组织，Ⅰ型胶原酶消化离心去上清后，加入含10%胎牛血清和U/mL青霉素、链霉素的α-MEM培养基置于培养瓶中，37℃孵箱内培养。（2）流式细胞术鉴定：将P1代细胞消化重悬分装后每个离心管分别加入2μL抗人单克隆荧光标记抗体Stro-1-FITC、CD34-PE，CD45-FITC、CD90-PE、CD-PE、CD-PE。4℃避光孵育2h，再用PBS洗涤3次，r/min离心5min，最后以μLPBS重悬细胞。流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性表达率，用百分比（%）表示。
1.2.5冻干牙片与SHEDs复合培养（1）将冻干牙片及未处理的正常对照牙片放入24孔板中，并将第2代SHEDs接种在牙片上，每孔约2×个细胞，置于孵箱中培养3、6、18h后多聚甲醛固定牙片上的细胞，扫描电镜观察细胞黏附生长情况。（2）同上述方法，将接种SHEDs细胞后的牙片置于孵箱中培养3、6、18h后进行Hoechst染色，倒置显微镜下观察细胞数目变化。（3）SHEDs在冻干牙片表面的增殖能力检验（MTT实验）：同上述方法，将接种SHEDs细胞后的牙片置于孵箱中分别培养1、3、5、7d后终止培养，然后将牙片转移到新的24孔板中，加入MTT溶液避光培养4h后吸弃每孔中上清液，再向每孔中加入μLDMSO，震荡以溶解紫色结晶，将液体转移至96孔板，用分光光度计在nm波长下检测各组的吸光度值。
1.3统计学处理采用SPSS16.0软件对所有测量结果进行分析，两标本组间比较采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。
2结果
扫描电镜观察冻干牙及未处理的正常对照牙牙本质小管结构发现，冻干牙牙本质表面更加光滑，玷污层较少见，牙本质小管的开放程度较好且没有胶原结构的塌陷（图1）。
显微硬度测试结果发现，经冻干后牙本质及牙釉质的显微硬度略有下降，但与未处理正常对照牙间无显著性差异（图2）。
分离培养的SHEDs在形态上与恒牙牙髓干细胞相似，细胞略小，多为纺锤形或长梭形。根据以往文献选取Stro-1、CD90、CD、CD为阳性标记物，其阳性表达率分别为6.85%、99.01%、99.48%、99.45%；CD34、CD45为阴性标记物，其阳性表达率为0.73%、0.47%。结果提示该细胞为间充质干细胞来源，而非造血系来源的干细胞（图3）。
冻干牙片与SHEDs复合培养扫描电镜结果发现，在同一时间段冻干牙片上细胞的黏附生长情况要优于正常牙片（主要依靠观察细胞展开面积的大小及黏附伸展情况判断），随着培养时间的延长，细胞逐渐黏附在牙片上，细胞展开面积逐渐增大，在培养18h后细胞突起和伪足可横跨牙本质小管，牢固地附着于牙片表面（图4）。
冻干牙片与SHEDs复合培养进行Hoechst染色，倒置显微镜下观察发现，随着培养时间的延长，牙片上黏附的细胞数目逐渐增多，在培养18h的牙片上可看到明显的细胞聚集现象。对不同时间段不同牙片上的细胞数目进行统计分析发现，相同时间段冻干牙片上的细胞数要略多于正常牙片上的细胞数，且在培养18h时差异有统计学意义（图5）。
MTT实验结果显示，随培养时间延长，两组细胞的增殖率逐渐上升。在相同培养时间，冻干牙片上细胞增殖率要率高于正常牙片（图6）。
3讨论
近年来，学者们希望通过医学的发展找到解决口腔健康领域问题的新方法，于是提出了“再生牙科（regenerativedentistry）”的概念，以期利用干细胞研究、细胞分子生物学、组织工程技术、材料学等多学科研究新进展的交叉应用来再生牙体及口腔组织，但由于牙齿结构的限制，牙齿硬组织的再生仍很困难，全牙的再生仍是无法攻克的难题［7］。Li等［8］利用处理过的人牙本质基质（hTDM）结合人牙囊干细胞进行大鼠体内移植，结果显示，hTDM有利于细胞的黏附增殖并能诱导和促进牙本质的再生，是人类牙本质再生研究的一种理想的生物材料。另有文献通过对CCK-8增殖的检测及对骨生成相关蛋白［如Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）］和转录因子Runx2表达的检测证实，hTDM能促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化［9］。这说明牙齿本身的结构是一种良好的天然生物支架材料。
在骨组织工程中，异体冻干骨含有促进骨修复的天然必需因子和具有骨引导作用的胶原支架基质，已作为支架广泛用于骨缺损的再生修复［10］。Bagherifard等［11］对严重胫骨平台骨折自体或同种异体骨移植术后骨重建并发症的发生率、临床和放射学结果等进行对比分析，证实同种异体移植骨可以作为自体骨移植的替代物应用于临床。对上颌窦底提升术后骨完全成熟的愈合时间及骨小梁组织形态定量分析，证实自体骨和异体冻干骨制备品的临床效果无差异［12］。
SHEDs是组织工程优良的种子细胞，其分化潜力并不局限于成牙本质细胞及牙髓细胞，还可以分化成多种细胞类型，包括神经元、成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞激素分泌细胞（如肝细胞和胰岛细胞）。高可塑性的特征使其成为生物医学领域一个很好的干细胞研究模型［3］。有文献表明，其可起到抗炎及促进创伤愈合的作用而被应用于疾病的治疗［13］。
组织工程构建过程中．对支架材料的机械性能及生物相容性进行检测以满足实验要求是最基础的材料评价方法［14］。在机械性能方面，由于牙齿本身形状的限制，无法测量其挠曲强度、抗压强度等指标，只能测量在口腔领域应用较普遍的维氏硬度（HV）。维氏硬度测试结果证明冻干过程不会影响牙本质及牙釉质的硬度，这与Jiao等［15］的文献中对牙本质基质进行深冷冻后的维氏硬度测试结果描述一致。扫描电镜观察结果及维氏硬度测试结果证明了在机械性能方面冻干牙作为支架材料的可行性。利用MTT比色法这种检测细胞存活和生长较为敏感的方法来观察冻干牙对细胞增殖的影响。通过SHEDs与冻干牙复合培养，观察在不同时间段细胞形态及数量的变化情况发现，冻干牙对SHEDs的生长无明显抑制作用，随着培养时间的延长，细胞数量明显增加，细胞的增殖率也有显著上升。扫描电镜观察到SHEDs能够牢固黏附于冻干牙表面生长，证实了冻干牙良好的生物学相容性。
本实验通过成功制备人冻干牙，并对其机械性能及细胞相容性进行检测，证实了人冻干牙作为牙再生支架材料的可行性，为后续应用其构建全牙再生实验研究奠定了一定的基础。
参考文献略
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