深度循环肿瘤细胞CTCs检测对头颈
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干货
靠谱
实用
作者
乐飚1,宋毅1，邬振华2，郝敬铎3，沈挺1，张晓晶1
1：宁波美晶医疗技术有限公司
2：医院
3：医院胃肠外科
摘要
头颈部肿瘤包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤三大部分，据世界卫生组织（WHO）评估近年我国头颈部肿瘤的年发病率为每10万人中15.22人次（15.22/10万），占全身恶性肿瘤的4.45%。早期无明显临床症状，目前其治疗方案是以手术治疗为辅，放疗化疗为主。芝加哥大学医学院的报道显示即使行手术或局部放化疗，其远端转移转移率仍高达4-23%，且往往提示着不良的预后。由于临床确诊的头颈部肿瘤主要为进展期，从而失去了最佳治疗的时机，而头颈部肿瘤的临床常见致残、致死的主要原因为肿瘤的复发和转移。外周血循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells,CTCs)被认为与恶性肿瘤的复发、转移密切相关，因其对肿瘤的早期诊断、临床分期、复发转移和耐药监测、预后判断、开发新的治疗靶点具有重要价值。美晶医疗与临床合作代表就目前CTCs检测技术在肿瘤辅助诊疗和预后的意义进行归纳总结，以期为今后肿瘤的复发转移和耐药监测、预后判断，治疗策略的及时调整，开发新的治疗靶点提供新的思路和重要依据。
头颈部肿瘤包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤三大部分。比较常见的是：甲状腺肿瘤，喉癌、副鼻窦癌及各种口腔癌（如舌癌、牙龈癌、颊癌等，见图1）。
图1：头颈部淋巴结与组织示意图（源自中医院头颈部肿瘤放射治疗图谱）
因此，头颈部肿瘤的原发部位与病理类型居全身肿瘤之首。同时，头颈部重要器官比较集中，解剖关系复杂，治疗方法各异。
据WHO评估，我国近年头颈部肿瘤的年发病率为每10万人中15.22人次（15.22/10万），占全身恶性肿瘤的4.45%。按部位，头颈肿瘤的发病依次为喉(32.1%)、甲状腺(19.6%)、口腔(16.1%)、鼻咽(14.9%)、鼻腔副鼻窦(6.6%)、大涎腺(4.2%)、口腔(3.3%)、眼(1.52%)、下咽(1.5%)。在性别上，除甲状腺肿瘤女性(14.2%)明显多于男性(5.40%)外（见图2），其余以男性居多。
头颈部肿瘤病灶部位和频率统计
其病因尚未查清，有人认为与遗传因素有关；长期接触有害的化学气体及吸烟，亦为诱发因素之一。
什么是循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs）是指从原发性实体瘤或转移灶释放，突破血管从而进入外周循环血的肿瘤细胞。
由于CTCs的稀有性，抗原异质性而难以富集/捕获，研究者早期主要致力于CTCs的富集与捕获。
目前CTCs已成为多种类型癌症，如乳腺癌，肺癌，前列腺癌和结肠直肠癌对于良、恶性肿瘤的鉴别有一定的提示价值。
美晶医院放化疗科，医院及宁波七院胃肠外科的临床合作中对不能手术或不愿手术的局部进展期胃癌患者进行同步放化疗,并观察疗效和不良反应,取得了较好的效果，发现CTCs在胃癌的预后评估及个体化治疗，疗效监控等方面具有重要的临床意义。但CTC在头颈部肿瘤中的研究相对较少。
本文主要从CTCs的特性、检测手段及其在头颈部肿瘤中的应用进行概述。
1．循环肿瘤细胞的特性与检测手段
自年Ashworth首次报道外周血循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell,CTCs)的发现以来，关于CTCs的出现是”肿瘤转移扩散“还是仅为原发病灶脱离的”单纯肿瘤细胞“的问题已经讨论了近半个世纪之久。
在过去的10数年，伴随着分子病理学，免疫细胞组化等高敏技术的诞生，又重新燃起了CTCs临床意义的研究热潮。年Abati等提出尽管外周血中仅有非常少的一部分CTC能存活下来并形成转移灶，但是CTC的存在就可能为转移额发生提供了基础，且近年的许多研究证实CTC的出现与患者的预后呈正向相关，美国德州大学MDAdeson病院的Christfani等数个研究团队证明，乳腺癌，结直肠癌患者CTC辅助临床诊断可以作为一个独立的预后指标。
肿瘤细胞从原发灶生长至发生转移与其他恶性肿瘤往往经历原发灶的原位生长（原位癌）、突破基底膜成为浸润癌、肿瘤细胞突破血管内皮细胞从而进入血液循环、随血液在全身播散的肿瘤细胞滞留于远处器官的毛细血管、在转移灶的定植和生长等恶性行为。
在这一过程中，CTCs被认为与恶性肿瘤的复发、转移密切相关，因其对肿瘤的早期诊断、临床分期、复发转移和耐药监测、预后判断、开发新的治疗靶点具有重要价值。
年德国海德堡大学普外科脏器与移植专业的Steiner团队在LangenbecksArchSurg上发表的研究指出，每克原发肿瘤灶或转移灶每天约有个CTC脱落进入外周血循环，而90%的CTC因为人体的免疫调节系统和自身凋亡而失去活力，且CTC在外周血细胞中阳性率较低，与正常血细胞的比值约千万分之一到亿分之一之间。
目前CTCs检测技术主要分为物理学模式（如以细胞大小差异和过滤为基础的方法等），正向/负向筛选模式或借助微流控芯片（CTC-Chip）。
作为中国自主研发的自动化循环肿瘤细胞检测系统，美晶医疗CellRichTM循环肿瘤细胞检测系统采用免疫纳米磁颗粒并结合先进的微流体芯片设计专利技术对微量细胞进行捕获和分析，是一种先进的循环肿瘤细胞检测与分析平台。该平台具备正负向细胞筛选模式：在正向筛选模式中，通过将循环肿瘤细胞上的特异抗原与纳米磁颗粒上的特异性抗体相结合，借助微流控专利技术使得含有肿瘤细胞的生物样本通过梯度磁场，从而将循环肿瘤细胞从血液或其他背景液中筛选出来。
在负向筛选模式中，通过对生物体液样本进行红细胞裂解处理，配合使用与白细胞、红细胞或血小板等特异性结合的免疫微珠等技术手段将循环肿瘤细胞之外的细胞进行去除，从而消除背景干扰对循环肿瘤细胞进行检测的技术手段。而此检测技术开发完成后，将与现有循环肿瘤细胞检测系统形成良好的互补和完善。更多细节详见美晶医疗转化医学网4月刊的基于微芯片的自动化循环肿瘤细胞检测系统?CellRichTM新型液体活检平台。
其临床检测模式以iFISH（原位荧光杂交），免疫荧光及PCR法应用较多，常见的有细胞角蛋白CK19；CK20；癌胚抗原（CEA）；Suivivin；Stanniocaclcin2；MicroRNA-21；各类人类染色体组（如CEP7,CEP8）等。目前，其在临床应用中最大的限制就是，缺乏特别明确的特异性标志物，以上问题导致当前CTC的研究停滞在原始阶段，对CTC的单细胞特性、分子标记物的种类及性质的理解均不充分，距离临床肿瘤病症诊疗的转化应用仍然有距离。
2．循环肿瘤细胞在头颈部肿瘤中的应用
头颈部肿瘤与其它肿瘤（如乳腺癌，前列腺癌或结直肠癌）相比，过去一直认为其预后主要取决于局部复发和区域性的淋巴转移，其远处转移的发生率仅在1%左右，因此关于CTC的临床研究相对较少。
然而伴随着ICC（免疫荧光检测），iFISH,PCR等高敏感，高特异性检测技术的发现与应用，又重新激起了对CTC临床意义的研究兴趣。近年许多研究证明CTC的出现不仅与患者的预后相关，还与肿瘤的组织学分级，肿瘤大小和淋巴结转移情况包括有无远处转移相关联。
Wollenbergtm，Funke，Pajonk等团队发表的多篇回顾性文献对于头颈部肿瘤远处转移的共识是：1）20世纪90年代，Berget等采用传统的酶免检测（例如碱性磷酸酶（AP）；C26或EMA单抗的免疫荧光检测（IF）；生物素-链酶亲和素架桥的辣根过氧化物酶（AB-PCX)模式；生物素-链酶亲和素架桥的碱性磷酸酶（AB-AP）模式等）几乎很难检测到目标的CTCs（表1：酶免检测在CTCs中的应用（引用自：FunkeIandSchrautW.JClinOncol.Feb;16(2):-66.）；2）伴随着分子病理学，免疫细胞组化等高敏技术的诞生，外周血模拟试验中质控细胞的捕获率已可达到95%及以上（图3：质控细胞捕获效率）；3）头颈部肿瘤是一种全身性疾病，患者的远处转移往往发生在肿瘤分级的中后期，而且预示着不良的预后。
因此认为远处转移的早期诊断对头颈部肿瘤的预后至关重要，且远处转利的高发生率与更短的生存期（OS)明显相关（图4：CTCs与预后的关联：引用自：PLoSOne.Aug8）
医院副院长兼外三科主任郝敬铎医师近日在宁波市惠民计划的赞助下，运用美晶医疗的CellRichTM新型液体活检平台对转移性肿瘤（入组数十例结直肠癌，前列腺癌，乳腺癌及头颈部肿瘤）患者实施CTCs检测时发现，在早期肿瘤患者中，利用影像学还未发现病灶时已经可以在外周血中检测到CTCs。
研究表明，在疾病的早期，外周血循环肿瘤细胞对于良、恶性肿瘤的鉴别有一定的提示价值，也有助于转移风险的预测和判断；在疾病进展和治疗过程中，外周血循环肿瘤细胞能为动态检测病情、耐药性等临床诊疗的关键因素提供重要信息，有助于医师开展个性化的肿瘤治疗。
3．循环肿瘤细胞在头颈部鳞状细胞癌中的应用
头颈部鳞状细胞癌（headandnecksquamouscellcarcinoma:SCCHN)是头颈部最常见的恶性肿瘤，约占头颈恶性肿瘤的90%，占全身恶性肿瘤的10%。
WHO统计，全球每年新增病例约65万例，治疗方式从单一手术转变为手术，放化疗，分子靶向治疗等多学科联合模式，任然有50-60%的患者出现原位复发，区域淋巴结转移，约有20%的患者发现远处转移，其5年生存率在50%左右，且近几十年来没有显著提高。因此CTCs做为可评估HNSCC的早期检测及预后的检测指标，而备受中科医院用爱心承担责任北京看白癜风哪家医院专业